「小远答疑」那些困扰你的Co-IP检测问题

原理简介

免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法，是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。

其原理是使用靶蛋白特异性抗体间接捕获与特定靶蛋白结合的蛋白来鉴定体内相关的蛋白-蛋白相互作用，是研究蛋白质互作的经典方法。特异性抗体捕获样品中的靶蛋白，形成抗体-靶蛋白复合物，然后利用能够与抗体结合的珠状支持物（例如Nanoab-Agarose）来固定和沉淀复合物，同时与靶蛋白相互作用的蛋白也会被沉淀下来，最后洗去与靶蛋白相结合的非特异性蛋白，再通过SDS-PAGE进行分析、Western blot检测。

常见问题解答

1、用Co-IP验证出两个蛋白互作，但是其他验证方式却不互作，是不是Co-IP不可靠？

Co-IP可以验证两个蛋白之间互作的关系，用其他验证方式却不互作可能是因为Co-IP中存在中间蛋白参与互作导致的。

2、为什么其他方式能验证出两个蛋白之间有相互作用，用Co-IP却没有验证出来？

Co-IP是验证蛋白之间相互作用的经典方法，但是有一定的灵敏度，对于有些弱相互作用或由于蛋白表达量太低而检测不出来的，属于正常范畴。

3、Co-IP实验中没有检测到与目的蛋白相互作用的蛋白或检测得到的信号太弱？

可能是蛋白和蛋白之间的相互作用太弱或不稳定导致的。

4、Co-IP中的input/IP/IB分别是指什么？

Input指的是总蛋白，属于阳性对照，IP是用相应的抗体沉淀相应的蛋白，IB指互作信号。

5、Co-IP实验对抗体有什么要求？

若是自身蛋白抗体，抗体需要达到IP级别，并且需要测试其效价，商业化的标签抗体也需要达到IP级别。

6、Co-IP实验如何避免出现假阳性？

（1）若抗体浓度高，则降低抗体浓度；

（2）若抗体特异性不好，则更换抗体；

（3）若蛋白丰度非常高，则可以加大洗涤次数。

7、Co-IP中的ProteinA/G琼脂糖珠有何作用？

ProteinA/G能特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段，因此能和抗体结合，而抗体与目标蛋白结合，目标蛋白和相互作用的蛋白结合。

8、Co-IP实验中使用的对照抗体有哪些？

单克隆抗体：正常小鼠的IgG或另一类单抗；多克隆抗体：正常兔IgG，如果是标签抗体用相应的标签蛋白作对照。

9、Co-IP实验中阴性对照的意义是什么？

排除非特异性蛋白的结合。

10、Co-IP实验中如何去除重链、轻链的影响？

用目前商业化的纳米抗体可以有效避免，或者在WB的过程用特异性二抗去排除。

11、Co-IP中没有检测到与目的蛋白相互作用的蛋白或检测得到的信号太弱的原因有那些？

（1）裂解液中的去垢剂浓度太高或配方过于剧烈：此时降低去垢剂浓度或更换去垢剂种类。

（2）受蛋白的亚细胞定位影响：应重新选择裂解液配方来释放目的蛋白。

（3）蛋白与蛋白之间的相互作用太弱或不太稳定：应选择亲和力更高的抗体以捕获更多的目的蛋白，从而捕获更多的相互作用蛋白。

（4）过表达提高目的蛋白的含量：选择目的蛋白或相互作用蛋白含量高的样品进行免疫共沉淀实验。

12、GST pull-down与Co-IP的区别

Co-IP：一般在体内进行，能够模拟体内蛋白真实的互作情况，但是无法分辨出是否存在第三者蛋白参与导致的互作。

GST Pull-down：一般指用一个带GST标签的重组蛋白，与目的蛋白进行孵育，最后用结合GST的Beads拉下相互作用复合物；通常利用原核表达出蛋白，该方法可以证明两个蛋白之间直接相互作用。

13、Co-IP实验失败的原因及解决方法有哪些？

（1）样品被蛋白酶降解，处理方法：添加蛋白酶抑制剂（protease inhibitor）；所有操作保持4℃以下冰上操作并防止冻融。

（2）抗体浓度太低，处理方法：调整IP和/或IB抗体浓度，必要时设立浓度梯度，摸索最佳浓度。

（3）抗体亲合力太低，处理方法：选用适合于IP和/或IB的相应抗体。

（4）IP抗体未与琼脂糖珠子结合，处理方法：选用适合于IP的相应珠子，正确保存防止变质或干燥。

（5）Tag未暴露在融合蛋白构象的表面，处理方法：改变tag融合表达部位。

（6）裂解液严谨度太高，处理方法：改用低严谨度裂解液。

14、IP和Co-IP有什么区别？

IP：在已知一种蛋白质的抗体情况下，直接用这种抗体将目标蛋白质提取出来，是一种提纯蛋白质的方法。

Co-IP：主要用于检测蛋白质与蛋白质之间的相互作用。

如果你想检测蛋白质A与蛋白质B之间是否存在相互作用，你手中又有蛋白质A的特异抗体，就将蛋白质A和抗体加入到含有蛋白质B的细胞解液中去，利用抗体提纯，如果蛋白质A，B之间有相互作用，则最后提纯产物是抗体—蛋白质A—蛋白质B的复合物。由于最后终产物是多种蛋白质复合物，所以这种技术叫做Co-immunoprecipitation，和IP的用途区别还是很大的。

15、IP后WB鉴定到目的蛋白，为什么质谱未鉴定到？

质谱未发现目的蛋白，通常是由于蛋白本身在样品中相对丰度较低导致，由于质谱过程中其他相对高丰度的蛋白可能掩盖部分信号、导致样品中低丰度蛋白未被鉴定。

16、Co-IP需要准备多少样本量？

Co-IP实验需要保证足够的蛋白浓度才能维持原本存在的蛋白互作状态，尤其当蛋白丰度较低、相互作用力不强、使用不易提取蛋白的组织等情况时。并且Co-IP的实验条件往往需要反复摸索，因此用于Co-IP实验需准备细胞＞2x107，动物组织＞500mg，植物组织＞2g，样品采集后应速冻于-80℃保存并避免反复冻融。

17、Co-IP实验成功的评判标准是什么？

Input有目的条带，阴性对照无目的条带，互作组有目的条带说明Co-IP成功。

18、Co-IP下游还可以开展哪些分析实验？

Co-IP所获取的样品，可以借助特异性抗体进行WB验证某种特定蛋白的存在（即认为互作蛋白），也可进行蛋白质谱鉴定找出互作蛋白，尤其当寻找未知互作蛋白时更需通过质谱分析。

伯远生物可提供以下技术服务

Co-IP（用于验证蛋白-蛋白相互作用）

IP-MS（用于寻找已知蛋白和未知蛋白的相互作用）

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