作者丨小柯
m6A（N6-甲基腺嘌呤）修饰是哺乳动物细胞信使RNA (mRNA)内部丰度最高的碱基化学修饰 (3-5 m6A/mRNA)。
近几年来，越来越多的实验证据显示RNA m6A甲基化是转录后调控基因表达的一个新机制，引起了多学科领域科学家们的广泛关注，是一个前沿研究热点。
为了深入理解m6A甲基化的功能，单碱基分辨率信息是必需的，它能在碱基层次上帮助我们理解细胞内甲基化的机理和功能。
浙江大学刘建钊研究员课题组开发了一种基于细胞代谢标记的全转录组RNA高通量测序方法，简称m6A-label-seq，来获取m6A单碱基分辨率信息。
北京时间2020年4月27日晚23时， Nature Chemical Biology杂志以长文发表了该测序方法，题为“Ametabolic labeling method detects m6A transcriptome-wide at singlebase resolution”。
在m6A测序技术的发展中，2012年发表的基于m6A抗体免疫沉淀的高通量测序技术(m6A-seq或称MeRIP-seq)最为常用，但该方法只能提供100-200核苷酸的检测窗口。
领域内先后探索了一些RNA m6A单碱基或近乎单碱基分辨率的测序方法，包括基于抗体/RNA光交联的方法（PA-m6A-seq、miCLIP等）、基于RNAm6A甲基化敏感的内切酶法（m6A-REF-seq或称MAZTER-seq）、基于m6A结合蛋白融合碱基编辑蛋白的方法（DART-seq），这些方法都促进了领域的发展，但多数都是间接的手段。
m6A-REF-seq是一种直接的检测方法，但受限于内切酶的单一m6ACA序列选择性（非m6ACA序列不能被鉴定）。
因此，该领域还需要发展新的m6A单碱基分辨率测序方法，解决当前存在的问题。
细胞内S-腺苷甲硫氨酸（SAM）是甲基转移酶的辅助因子，可在mRNA m6A甲基转移酶(METTL3/METTL14)的作用下，将其甲基转移到mRNA上的特定腺嘌呤的N6位点形成m6A。
SAM是以甲硫氨酸和三磷酸腺苷（ATP）为原料，在甲硫氨酸腺苷转移酶（MAT）的催化下合成的。
作者从甲基化源头考虑，引入带有烯丙基修饰的甲硫氨酸，在细胞内MAT作用下生成烯丙基取代的辅助因子allyl-SAM或者硒代同源物allyl-SeAM (图1)。
细胞内METTL3/METTL14利用allyl-SAM或allyl-SeAM，将其烯丙基修饰到mRNA上原本是m6A的位点，得到a6A（N6-烯丙基腺嘌呤），a6A在温和的碘加成条件下诱导生成环化1,6位环化腺嘌呤(cyc-A) (图1)；然后，RNAcyc-A在逆转录成互补DNA（cDNA）时发生碱基错配；最后，借助高通量测序和生物信息学分析突变位点，得到了全转录组m6A位点的单碱基分辨率图谱。
图1. 示意图描述利用代谢标记测定RNA m6A精确位置的方法；(a) 代谢标记RNA m6A 位点为烯丙基修饰的a6A；(b) SAM及其烯丙基修饰的衍生物；(c)RNA a6A的化学处理与逆转录突变效应用于鉴定相应位点（图片源自文章）
研究人员利用m6A-label-seq方法对人体HeLa和HEK293T细胞系以及老鼠H2.35细胞系的mRNAm6A位点、位点距离、m6A共有基序等信息进行了系统分析。
结果显示部分检测到的m6A修饰位点倾向于成簇出现，相邻m6A位点之间的中位距离约为50 nt（图2a）。
并且，对A至C/T/G的突变位点进行序列分析，绝大部分共有序列为GGAC，与之前报道的m6A序列相符（图2b）。
此外，以HeLa细胞为例，选取了FRAT2、ZNF445、LATS1等11种基因的14个位点，展示了高通量测序下的突变位点，该位点即为m6A位点（图2c）。
研究人员还对选取的位点进行了低通量方法测序验证，以此确认这些位点的可靠性（图2d）。
为了进一步确认该方法的有效性，研究人员还将m6A-label-seq与miCLIP-seq、m6A-REF-seq、DART-seq等已知测序数据进行了对比，分析了各种方法之间鉴定的mRNA m6A位点重叠和差异比例情况。
最后，研究人员选取了16个m6A特征位点，用独立正交ELECTm6A鉴定方法验证了这些位点的可靠性。
综上，该研究的m6A测序方法特点如下：
（1）利用代谢对甲基化位点的源头标记并直接单碱基分辨率测定，相对于当前的间接方法有更高的准确率；
（2）适用于细胞内RNA多种不同甲基化序列(motif)的鉴定；
（3）对测定m6A簇修饰有优势。
该方法为将来研究细胞核内种类繁多的新生RNA的m6A甲基化位点及状态演变提供了重要工具。
另外，该方法在标记产率和标记时间窗口尺度方面还需要优化提高，为研究更多的细胞事件过程提供便利。
论文信息：
DOI：10.1038/s41589-020-0526-9